PENEGUHAN DIAGNOSIS KUCING SUSPECT TERINFEKSI FELINE INFECTIOUS PERITONITIS DENGAN TEKNIK REAL TIME RIVERSE TRANSCRIPTASE POLYMERASE CHAIN REACTION
Srihanto, E.A(1), Anggy, F.P(1), Firwantoni(1), Febriyani, D.A(1),
Putri, A.J(1) dan Avrilianti, N.A(2)
1. Laboratorium Bioteknologi, Balai Veteriner Lampung
2. Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga
Abstrak
Feline Infectious Peritonitis (FIP) merupakan penyakit fatal yang terjadi pada kucing domestik dan liar di seluruh dunia. Agen penyebabnya adalah Feline coronavirus (FCoV). Prevalensi feline enteric coronavirus (FECV) di lingkungan sangat tinggi dan sangat menular hampir di 100% kucing yang kontak dengan FECV dari feses kucing yang mengeluarkan virus. Penelitian ini bertujuan untuk meneguhkan diagnosis dan konfirmasi secara laboratoris terhadap agen penyebab kematian kucing. Sampel dikoleksi dari hasil nekropsi pada seekor kucing dengan temuan adanya cairan di rongga peritoneum. Temuan patologi anatomi lainnya berupa adanya pneumonia dan pembengkakan pada hati. Sampel uji berupa cairan peritoneum. Cairan bersifat serous-purulen dengan warna kekuningan. Peneguhan uji dengan menggunakan teknik realtime riverse transcriptase polymerase chain reaction. Hasil uji menunjukkan sampel terdeteksi positip virus feline infectious peritonitis. Hasil laboratorium dapat digunakan sebagai data pendukung dalam rangka pengobatan terhadap infeksi virus feline infectious peritonitis.
Kata kunci : feline infectious peritonitis, peneguhan diagnosis, real time reverse transcriptase polymerase chain reaction
PENDAHULUAN
Feline Infectious Peritonitis (FIP) merupakan penyakit fatal yang terjadi pada kucing domestik dan liar di seluruh dunia. Agen penyebabnya adalah Feline coronavirus (FCoV). Prevalensi feline enteric coronavirus (FECV) di lingkungan sangat tinggi dan sangat menular hampir di 100% kucing yang kontak dengan FECV dari feses kucing yang mengeluarkan virus. Infeksi sebagian besar bersifat asimtomatik atau hanya menyebabkan diare ringan dan sementara. Penularan FIPV tidak melalui jalur fekal-oral, tetapi muncul melalui mutasi dari avirulen FECV yang yang menginfeksi sebagian kecil kucing dan kemudian menyebabkan penyakit fatal peritonitis infeksius kucing (FIP) (Vennema et al., 1998; Pedersen et al., 1981a; Pedersen et al., 1981b). Masih belum diketahui gen mana yang tepat mengandung mutasi yang menyebabkan perkembangan FIPV. FIP paling sering terjadi pada kucing muda di bawah usia dua tahun (Riemer et al., 2016). Kucing jantan (Riemer et al., 2016) dan ras tertentu diperkirakan lebih sering terkena (Pesteanu-Somogyi et al., 2006; Pedersen et al., 2004; Rohrbach, 2001). Tanda-tanda klinis, seperti anoreksia, lesu, penurunan berat badan, demam, tanda-tanda okular dan neurologis seperti kelainan gaya berjalan atau gangguan mental, bersifat non-spesifik (Riemer et al., 2016; Giori et al., 2011; Pedersen, 2009; Kipar and Meli, 2014; Singh et al., 2005). Hal yang sama berlaku untuk kelainan klinikopatologis. Pada saat yang sama, diagnosis pasti sulit dilakukan, karena sebagian besar tes diagnostik yang ada tidak dapat membedakan antara FECV dengan FIPV dan terutama pada kucing tanpa efusi rongga tubuh, seringkali sulit untuk mencapai diagnosis pasti sebelum kematian. Penelitian ini dilakukan sebagai peneguhan diagnosis terhadap kematian kucing. Diagnosis yang tepat diperlukan sebagai dasar pemberia obat antiviral yang tepat.
MATERI DAN METODE
Materi
Sampel uji berupa cairan peritoneum. Cairan peritoneum dikoleksi dari bangkai kucing pada saat nekropsi. Cairan peritoneum bersifat seropurulent dengan warna kekuningan. Materi uji untuk ekstraksi digunakan QiAmp Viral RNA minikit (Lot.no. 1720.37949). Amplifikasi DNA menggunakan kit SensiFast One Step Kit (cat. No. BIO-78005).
Gambar 1. Akumulasi cairan peritoneum (a); Koleksi sampel uji (b)
Metode
Ekstraksi RNA sampel
Ekstraksi RNA sampel digunakan kit QiAmp Viral RNA mini kit (cat.no. 52906). Sebanyak 140 µl sampel dilisiskan dan dilakukan proses diinaktivasi virus. Pengikatan RNA terjadi di membran silika. Proses pencucian dengan menggunakan wash buffer dilakukan 2 kali dan dilanjutkan dengan proses elusi dengan menggunakan buffer AVE. Sebanyak 60 µl RNA didapatkan dan dilanjutkan dengan proses pengujian.
Real time RT-PCR
Deteksi FIP virus menggunakan metode real time reverse transkriptase PCR. SensiFast One Step Kit (cat. No. BIO-78005) digunakan untuk amplifikasi RNA. RNA template (3 µl) ditambahkan pada 10 µl PCR 2x Mix, 0,2 µl RT Mix, 0,4 µl RNA inhibitor, 4 µl RNase-free water dan 2,4 µl primer probe mix. Konsentrasi primer yang digunakan 20 pmol dan konsentrasi probe 5 pmol . TaqMan probe dilabel 5’FAM/3’BHQ-1. Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi menargetkan pada gen 3’UTR. Primer probe yang digunakan berdasarkan desain dari Gut el.al (1999). Sekuens primer probe ditampilkan pada Tabel 1.
Tabel 1. Sekuens primer probe FIP
|
Primer |
Sekuens |
|
Forward |
GAT TTG ATT TGG CAA TGC TAG ATT T |
|
Reverse |
AAC AAT CAC TAG ATC CAG ACG TTA GCT |
|
Probe |
TCC ATT GTT GGC TCG TCA TAG CGG A |
Amplifikasi RNA : reverse transcription pada 450C selama 10 menit, denaturasi awal pada 950C selama 2 menit, 45 siklus untuk denaturasi pada 950C selama 15 detik dan annealing-elongasi pada 600 C selama 45 detik.
Analisis data
Analisis data dilakukan secara deskriptif yang didasarkan pada nilai Ct yang dihasilkan dari perpotongan garis threshold dengan siklus. Nilai threshold digunakan 0,05. Sebagai quality assurance digunakan kontrol negatip dan kontrol reagen (no template control).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari hasil pengujian didapatkan sampel terkonfirmasi positip terhadap virus FIP. Nilai Ct yang didapatkan adalah 27,84. Hal ini menandakan bahwa kematian kucing disebabkan oleh infeksi virus FIP.
Gambar 2. Kurva hasil uji sampel terkonfirmasi positip FIPV. Sampel lapang (a); Kontrol positip (b)
Diagnosis ante mortem FIP sangat sulit dilakukan pada kucing terutama pada kucing yang tanpa cairan abnormal yang signifikan. Beberapa penyakit yang mirip seperti gagal jantung congestive, penyakit hati yang menyebabkan ascites, gagal ginjal, bacterial peritonitis, toxoplasmosis dan limfoma dapat menunjukkan adanya gejala klinis yang sama. Diagnosis pasti tidak dapat dibuat hanya berdasarkan anamnesa, riwayat penyakit dan tanda klinis serta hasil laboratorium. Parameter-parameter ini harus selalu dievaluasi sebagai suatu kesatuan dan berpotensi bersamaan dengan parameter lain seperti hasil tes molekuler atau bahkan tes diagnostik yang lebih invasif. Untuk menghindari kesalahan diagnosis FIP pada kucing yang tidak terinfeksi, spesifisitas selalu menjadi nilai diagnostik terpenting yang perlu dipertimbangkan.
Tes diagnostik yang sering digunakan meliputi deteksi anti FCoV-antibody, deteksi antibody kompleks (Elisa), deteksi antigen FCoV pada makrofag dengan Immunostaining dan pengujian dengan NAAT (nucleic acid amplification test). Sampel yang digunakan meliputi darah, cairan serebrospinal, cairan peritoneum, jaringan (lgl. mesenterika, omentum, limpa). Secara umum, tes menggunakan efusi memiliki nilai prediksi yang jauh lebih baik dibandingkan tes menggunakan darah pada pengujian NAAT. Berbagai macam sampel secara umum dapat digunakan untuk memperkuat tes diagnostik terhadap infeksi FIPV (Stranieri et al., 218; Hartmann et al., 2003). Beberapa penelitian melaporkan sampel yang paling direkomendasikan untuk pengujian FIP adalah cairan efusi yang berasal dari peritoneum (Simon et al., 2005; Hartmann et al, 2003; Herrewegh et al, 1995). Hasil uji dari sampel tersebut dilaporkan memiliki sensitifitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan sampel lain seperti PBMC atau serum. Dengan diagnosis laboratorium yang tepat, hasil uji dapat digunakan sebagai pendukung diagnosi definitip untuk memastikan agen penyebab dan memastikan perbedaan dengan penyakit lain yeng memiliki gejala klinis yang hamper sama. Diagnosis yang tepat dapat membantu penanganan dalam terapi dan pemberian obat yang tepat bagi kucing yang terinfeksi.
KESIMPULAN
Dari hasil pengujian sampel cairan peritoneum dikonfirmasi positip FIPV. Sampel cairan peritoneum merupakan sampel yang direkomendasikan untuk kasus FIP tipe basah. Sedangkan jaringan dari lgl. mesenterika dan limpa dapat digunakan sebagai sampel uji pada kasus FIP tipe kering.
DAFTAR PUSTAKA
Giori, L., Giordano, A., Giudice, C., Grieco, V. and Paltrinieri, S. 2011, Performances of different diagnostic tests for feline infectious peritonitis in challenging clinical cases. J. Small Anim. Pract. 52, 152–157
Gut, M., Leutenegger, C.M. and Huder, J.B. 1999. One-tube fluorogenic reverse transcription-polymerase chain reaction for the quantitation of feline coronaviruses. J Virology Meth; 77: 37–46
Hartmann, K., Binder, C., Hirschberger, J., Cole, D., Reinacher, M., Schroo, S., Frost, J., Egberink, H., Lutz, H. and Hermanns, W. 2003. Comparison of different tests to diagnose feline infectious peritonitis. J. Vet. Intern. Med. 17, 781–790
Herrewegh, A.A., de Groot, R.J. and Cepica A. 1995. Detection of feline coronavirus RNA in feces, tissues, and body fluids of naturally infected cats by reverse transcriptase PCR. J Clin Microbiol; 33: 684–689
Kipar, A. and Meli, M.L. 2014, Feline infectious peritonitis: Still an enigma? Vet. Pathol. 51, 505–526.
Pedersen, N.C. 2009, A review of feline infectious peritonitis virus infection : 1963–2008. J. Feline Med. Surg. 11, 225–258
Pedersen, N.C., Sato, R., Foley, J.E. and Poland, A.M. 2004. Common virus infections in cats, before and after being placed in shelters, with emphasis on feline enteric coronavirus. J. Feline Med. Surg. 6, 83–88
Pedersen, N.C., Boyle, J.F. and Floyd, K. 1981, Infection studies in kittens, using feline infectious peritonitis virus propagated in cell culture. Am. J. Vet. Res. 42, 363–367
Pedersen, N.C., Boyle, J.F., Floyd, K., Fudge, A. and Barker, J. 1981, An enteric coronavirus infection of cats and its relationship to feline infectious peritonitis. Am. J. Vet. Res. 42, 368–377
Pesteanu-Somogyi, L.D., Radzai, C. and Pressler, B.M. 2006, Prevalence of feline infectious peritonitis in specific cat breeds. J. Feline Med. Surg. 8, 1–5.
Riemer, F., Kuehner, K.A., Ritz, S., Sauter-Louis, C. and Hartmann, K. Clinical and laboratory features of catswith feline infectious peritonitis-a retrospective study of 231 confirmed cases (2000–2010). J. Feline Med. Surg. 2016, 18, 348–356
Rohrbach, B.W., Legendre, A.M., Baldwin, C.A., Lein, D.H., Reed, W.M. and Wilson, R.B. 2001, Epidemiology of feline infectious peritonitis among cats examined at veterinary medical teaching hospitals. J. Am. Vet. Med. Assoc. 218, 1111–1115
Singh, M., Foster, D.J., Child, G. and Lamb, W.A. 2005, Inflammatory cerebrospinal fluid analysis in cats: Clinical diagnosis and outcome. J. Feline Med. Surg. 7, 77–93
Simons, F.A., Vennema, H. and Rofina, J.E. 2005. A mRNA PCR for the diagnosis of feline infectious peritonitis. J Virol Methods; 124: 111–116.
Stranieri, A., Giordano, A., Paltrinieri, S., Giudice, C., Cannito, V.and Lauzi, S. 2018. Comparison of the performance of laboratory tests in the diagnosis of feline infectious peritonitis. J. Vet. Diagn. Investig., 30, 459–463.
Vennema, H., Poland, A., Foley, J. and Pedersen, N.C. 1998, Feline infectious peritonitis viruses arise by mutation from endemic feline enteric coronaviruses. Virology. 243, 150–157
